Биохимия старения - Канунго М. С. (книги без регистрации TXT) 📗

Пролиновые остатки гидроксилированы в основном в положении С-4, но в некоторой степени — и в положении С-3. В коллагене типа I и II С-3-гидроксилированный атом встречается только в соотношении 1 на цепь, а в коллагене типа IV-10- 15 на цепь. В реакциях гидроксилирования этих двух видов участвуют два разных фермента [84]. При ингибировании гидроксилирования пролина предотвращается образование тройной спирали мономера и уменьшается ее стабильность. Кроме того, при таком ингибировании коллаген не накапливается в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме и не выделяется из клетки. Гидроксилирование происходит до образования тройной спирали, так как было показано, что она не является субстратом в реакции гидроксилирования [10]. Гидроксилирование пролина можно предотвратить включением его аналогов, ограничением количества кислорода и связыванием железа в хелат. В заключение отметим, что гидроксилирование пролина является ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гидроксилирование лизинового остатка

Лизин включается в про-α-цепи в ходе трансляции. Его гидроксилирование катализируется лизилгидроксилазой [48]. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 550000 и 200000 [60]. Как и для пролилгидроксилазы, для его активации необходимы молекулярный кислород, α-кетоглутаровая кислота, Fe²⁺ и аскорбиновая кислота. Обе гидроксилазы имеют близкие значения К_М. Они обратимо ингибируются n-хлормеркурибензоатом (nХМВ), что указывает на участие в катализе SH-групп фермента. Дитиотрейтол увеличивает активность обеих гидроксилаз. Как и гидроксилирование пролина, гидроксилирование лизиновых остатков происходит до образования тройной спирали. Обе гидроксилазы, выделенные из изолированных клеток сухожилия куриных эмбрионов, ингибируются гидрокортизонацетатом [55]. Последний ингибирует также синтез коллагена, причем это ингибирование обратимо. Содержание гидроксилизина (Hyl) различно в коллагене разных типов и с возрастом увеличивается [6]. При недостатке витамина D содержание Hyl в коллагене растет [80].

Если гидроксилирование пролина необходимо для формирования тройной спирали, то гидроксилирование лизина нужно для образования ковалентных поперечных сшивок между цепями, которое происходит вне клетки. Остатки Hyl, кроме того, служат центрами присоединения Сахаров. Недостаток лизилгидроксилазы в организме приводит к нарушениям в структуре соединительных тканей, при которых наблюдаются аномальные механические свойства кожи и связок (синдром Элерса — Данлоса). В ходе развития организма уровень лизилгидроксилазы понижается [7]. Таким образом, она также может быть ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гликозилирование проколлагена

Гликозилирование проколлагена — это посттрансляционная модификация про-α-цепей, которая представляет собой ферментативный процесс, протекающий внутриклеточно в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме до того, как тройная спираль проколлагена выйдет из клетки. В молекуле коллагена есть галактозилоксилизиновые и глюкозилгалактозилоксилизиновые остатки. Галактозиловая группа связана 0-гликозидной связью с гидроксильной группой Hyl (0-β-D-галактопиранозилоксилизин). Вблизи центра гликозилирования наблюдается характерная последовательность аминокислот: Gly — X - Hyl — Arg [49]. Считают, что эта область может быть носителем главной антигенной детерминанты коллагена. Вносит ли гликозилирование свой вклад в образование сшивок между цепями и (или) в соединение мономеров при формировании фибрилл коллагена, неизвестно.

В реакции гликозилирования принимают участие ферменты галактозилтрансфераза и глюкозилтрансфераза. Они переносят галактозиловый и глюкозиловый остатки UDPгликозида на оксилизин и галактозилоксилизин про-α-цепей в цистернах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Кофактором для того и другого фермента служит Mn²⁺. Глюкозилтрансфераза представляет собой одиночную цепь с мол. массой 70000. Этот фермент высоко специфичен и катализирует только перенос глюкозы на галактозиловый остаток про-α-цепи [1, 2]. Субстратом для обоих ферментов является только одиночная про-α-цепь. Ни тройная спираль мономера проколлагена, ни свободный Hyl не гликозилируются. Кроме того, эта реакция протекает при специфической последовательности аминокислот в цепи Gly — X - Hyl, если X не является Pro или Hyp. Это указывает на то, что гликозилирование происходит до того, как про-α-цепи агрегируют. Следовательно, скорость формирования тройной спирали может определяться скоростью гликозилирования. In vitro гликозилирующий фермент из клеток сухожилия куриного эмбриона ингибируется кортизолацетатом [55].

Таблица 4.2. Процессы биосинтеза коллагена

Все четыре фермента, необходимые для внутриклеточной модификации про-α-цепей: пролил- и лизилгидроксилазы и галактозил- и глюкозилтрансферазы, у куриных эмбрионов имеют наибольшую активность в возрасте 14–16 сут [66]. Степень гидроксилирования лизиновых остатков в коллагене типов I и III мала, и, следовательно, в тканях, которые содержат этот коллаген, низок уровень галактозил- и глюкозилтрансферазы. В коллагене типов II и IV, который имеется в связках и в базальных мембранах соответственно, гидроксилирование лизина протекает активно, и уровень гликозилтрансфераз здесь также высок. Степень гликозилирования в коллагене разных тканей различна.

Секреция проколлагена

Тройная спираль проколлагена выделяется в межклеточный матрикс. В клетках фибробластов в культуре in vitro при ингибировании образования микротрубочек уменьшается выход проколлагена, а также его превращение в коллаген. Выход проколлагена из фибробластов уменьшается и при ингибировании гидроксилирования пролиновых остатков путем связывания Fe2+ в хелаты или путем инкубации клеток в анаэробных условиях. Добавление в среду инкубации аналогов пролина и лизина приводит к тому же результату. Считают, что скорость синтеза коллагена регулируется гидроксилированием пролиновых остатков, внутриклеточным пулом пролина и уровнем пролилгидроксилазы. Существует также несколько других контрольных пунктов — это трансляция на полисомах, агрегация цепей и их секреция. Нарушение процессов в любом из этих пунктов может замедлить синтез коллагена. Схема его синтеза выглядит следующим образом:

Внеклеточные процессы

Частичный протеолиз

Тройная спираль проколлагена после выхода в межклеточный матрикс подвергается частичному протеолизу и превращается в полностью сформированный мономер коллагена [85]. Две разные проколлагенпептидазы, обе внеклеточные, одна — специфическая для NH₂-концевого пропептида, другая — для COOH-концевого пропептида, отщепляют от NH₂- и COOH-концов соответственно неспиральные пропептиды [41, 51, 54]. Первым отщепляется NH₂-пропептид, затем COOH-пропептид [13]. Пептидазы не являются сериновыми ферментами и не ингибируются SH-реагентами [25]. NH₂-пептидазу выделили в чистом виде из кожи, сухожилия и связок крыс и костей кур. Она активна при нейтральном рН и не ингибируется n-хлормеркурибензоатом (nХМБ). Одиночные про-α-цепи также служат субстратом для этого фермента. Он расщепляет пептидные связи между X — Glu и X — Gin. Затем Glu и Gin на NH₂-конце циклизуются в остатки пирролидонкарбоновой кислоты. Каждая полностью сформированная цепь в результате содержит ~1012 остатков и имеет мол. массу 95000. Девяносто пять процентов каждой цепи имеют в каждом третьем положении, за исключением небольших участков на NH₂- и COOH-концах, глициновый остаток. Об изменениях проколлагенпептидазы с возрастом имеющиеся сведения скудны. Известно, лишь, что при наследственной болезни крупного рогатого скота — дерматозпараксизе (неэластичная кожа, слабые суставные связки), для которой характерна невыраженная бороздчатость коллагена, уровень фермента очень низок.